昆蟲ELISA試劑盒方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。但ELISA測(cè)定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，在檢測(cè)過程中除正常反應(yīng)外，有時(shí)常見到一些錯(cuò)誤的結(jié)果。引起昆蟲ELISA試劑盒測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：①標(biāo)本因素;②試劑因素;③操作因素。下面就一些常見ELISA操作過程中的問題一一分析。
1.樣品稀釋
酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng)，如果血清不稀釋，不可避免會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性。
2.試劑盒平衡
試劑盒中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗(yàn)前平衡至室溫（約25℃），一般需在室溫放置20——30分鐘以上。平衡時(shí)間太短會(huì)造成試劑混勻不夠，樣品孵育時(shí)間相對(duì)縮短，ELISA反應(yīng)不夠充分。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。
3.昆蟲ELISA試劑盒樣品和試劑的混勻
稀釋前、后的樣品必須充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗(yàn)的均一性。
4.加樣
在現(xiàn)在的ELISA試劑盒中，必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性
5.溫育
溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗zui為關(guān)鍵的一個(gè)因素。
6.洗板
固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相免疫測(cè)定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過程中吸附的非特異成份分離開來，以保證ELISA測(cè)定的特異性。
7.昆蟲ELISA試劑盒邊緣效應(yīng)
使用96孔板的ELISA測(cè)定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深。經(jīng)研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板也升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。
8.顯色
顯色一定要控制時(shí)間，根據(jù)試劑盒說明操作即可。一般來說，顯色時(shí)間過短，結(jié)果偏低;顯色時(shí)間過長(zhǎng)，空白增高或者非特異性顯色增加。
9.比色
比色要注意波長(zhǎng)的選擇。以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長(zhǎng)為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問題。
其次，單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)比色選擇的問題。所謂的單波長(zhǎng)比色即是通常的以對(duì)顯色具有吸收的波長(zhǎng)如450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定;而雙波長(zhǎng)雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長(zhǎng)如450nm和非敏感波長(zhǎng)如630nm下各測(cè)定一次，敏感波上下的吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和;非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定即改變波長(zhǎng)至一定值，使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時(shí)測(cè)得的吸光度即為臟物的吸光度值。